摘 要：為了保持養(yǎng)殖大黃魚肌肉質(zhì)量，延長貨架期，本試驗采用冷藏保鮮、冰藏保鮮、 ClO?保鮮等三種保鮮方式對鮮黃魚進行處理。以大黃魚肌肉的微生物變化和品質(zhì)特性作為評價指標，并通過宏基因組高通量測序技術分析了經(jīng)上述三種方法處理后大黃魚肌肉優(yōu)勢菌屬的變化。

 結(jié)果表明：冷藏保鮮和冰藏保鮮的菌落總數(shù)和TVB-N值隨著貯存天數(shù)的增加而增大，而 ClO?保鮮相對于其他處理方式變化幅度最?。蝗N處理組的硬度、彈性和咀嚼性均先上升后下降，而 pH 呈先下降再上升的變化，以 ClO?保鮮組的變化幅度最?。?ClO?保鮮組在貯藏前期脂肪的氧化程度高于其他兩組，貯藏5 d 后差異顯著 (p<0.05)；通過電子鼻對大黃魚肌肉風味分析表明 ClO? 保鮮組對其風味保持效果較好；高通量測序結(jié)果顯示，三個處理組的優(yōu)勢菌屬均為希瓦氏菌屬、假單胞菌屬，但菌群結(jié)構(gòu)有所差別，ClO?可以減少大黃魚肌肉菌屬的種類。

大黃魚(Pseudosciaena crocea)是我國重要的經(jīng)濟水產(chǎn)養(yǎng)殖魚之一, 因其味道鮮美, 富含營養(yǎng)成分，而深受大眾歡迎。由于新鮮大黃魚含有較高的蛋白質(zhì)和水分，極易腐敗變質(zhì)。目前關于大黃魚的保鮮方法主要有輻照保鮮、超高壓保鮮、氣調(diào)保鮮、復合保鮮等，但因為面臨技術不成熟及商業(yè)成本高等問題還不能完全普及。冰藏保鮮是常見的保鮮方法，但大黃魚的肌肉易被腐敗微生物侵染而腐敗變質(zhì)。二氧化氯(Chlorine Dioxide，ClO?)作為一種新型的保鮮介質(zhì)，對水體中傳播的病原微生物、病毒、芽孢都有極強的殺滅作用，且具有安全無殘留，效率高、副產(chǎn)物少、成本低等優(yōu)點，是目前國際上公認的高效殺菌劑和食品保鮮劑，研究表明ClO?對微生物的細胞壁有較好的透過和吸附性能，控制微生物蛋白質(zhì)的合成，并使蛋白質(zhì)中的部分氨基酸發(fā)生氧化還原反應，使氨基酸分解破壞，最終導致微生物死亡。    

目前，國內(nèi) ClO?在果蔬保鮮方面有較多研究,但研究 ClO?對大黃魚肌肉保鮮處理的報道甚少。本研究選取大黃魚肌肉作為原材料，以三種不同的保鮮方式對其進行處理，測定其微生物變化和品質(zhì)特性，并利用高通量測序技術分析大黃魚肌肉腐敗菌，旨在進一步提高大黃魚肌肉品質(zhì)和延長產(chǎn)品保藏期，為穩(wěn)定型 ClO?冰對大黃魚肌肉的保鮮產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供指導。

1 材料與方法  

1.1 材料與儀器

大黃魚：選取表皮光澤無損傷，魚鱗完整并有少量透明粘液，個體均勻，重量約為(450±50) g/條的鮮活大黃魚。ClO? 試劑(A 試劑、B試劑)；基因組 DNA 抽提試劑盒；Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒 ； Taq DNA 聚合酶 ; MagicPure Size Selection DNA Beads 。A96FS70TI 型變頻冰箱; TX-XT plus 質(zhì)構(gòu)儀 ; PEN3 型電子鼻 ; Pico-21臺式離心機; 凝膠成像系統(tǒng) ; Q32866 Qubit? 2.0熒光計 Invitrogen; T100TM Thermal Cyeler PCR 儀BIO-RAD。

1.2 實驗方法

1.2.1 ClO?冰的制備

參照純歐德ClO?試劑說明書，配制濃度為300 mg/L 的高濃度的 ClO?溶液，將稀釋至5mg/L的溶液置于制冰機中, 制備大小約(0.75±0.25)cm3的穩(wěn)定型ClO?碎冰。

1.2.2 保鮮處理

活體大黃魚載氧運至實驗室后，放在冰水中30min冷卻致死后隨機分成三組，冷藏保鮮(CK組)：大黃魚裝入帶孔泡沫箱后并置于0~4℃環(huán)境下；冰藏保鮮(IC組)：大黃魚裝入帶孔泡沫箱后加入普通碎冰覆蓋，置于0~4℃環(huán)境下；ClO?保鮮(CD組)：大黃魚裝入帶孔泡沫箱后加入 ClO?碎冰覆蓋，置于 0~4℃環(huán)境下，不同組碎冰覆蓋厚度均為(3.0±0.5)cm，每隔24h補充一次碎冰。選取大黃魚背部肌肉去鱗、去皮進行指標測定, 并在第0、 1、3、5、9、13、17、21d進行樣品測定分析。

1.2.3 高通量測序鑒定

1.2.3.1 樣品預處理

將不同處理組的大黃魚放入滅菌泡沫盒中0~4℃條件下保藏7d后各取肌肉200mg。將樣品放入2mL 離心管中,加入70%乙醇溶液1mL, 震蕩, 離心(10000r/min,3min),移去上層液體。加入1xPBS溶液,震蕩混勻并再次離心(10000r/min,3 min),之后移去上層液體。將2 mL 離心管倒置于吸水紙上1m in 至無液體流出為止。離心管于55 ℃烘箱直至殘留酒精完全揮發(fā)。

1.2.3.2 宏基因組DNA的提取

采用E. Z. N. ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒提取總DNA, 并用凝膠電泳(濃度為1%瓊脂糖)對所提取總DNA 的完整性進行檢測，檢測濃度采用超微量分光光度計(Thermo NanoDrop 2000)。將檢測合格的總DNA 于-20℃條件下保存,用于后續(xù)實驗。

1.2.3.3 PCR 擴增及高通量測序

經(jīng) PCR 擴增, 使用Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒進行基因組 DNA 精確定量。用于PCR 擴增的引物與 Miseq 測序平臺的 V3-V4 通用引物已經(jīng)融合, 341F 引物:CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG; 805R 引物:GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GACTACHVGGGTATCTAATCC。 經(jīng)兩輪PCR 擴增完成接頭序列的連接。PCR 結(jié)束后，先利用瓊脂糖進行電泳鑒定，之后再進行DNA 純化回收。使用Qubit 2.0 DNA測定試劑盒精確定量回收的DNA，以便以1：1 的等量混勻后進行測序。每個樣品等量混合后的DNA 量取 10 ng，最終上機時測序濃度為20 pmol。

1.2.4 菌落總數(shù)

依據(jù)GB 4789.2-2016 菌落總數(shù)的測定。

1.2.5 pH

依據(jù)GB 5009.237-2016 食品中pH的測定。

1.2.6 質(zhì)構(gòu)特性測定

參考廖媛媛等的操作方法略作修改，將三組大黃魚室溫下解凍20min切取背部肌肉2.5cm×2.5cm×1.5cm| 的無刺樣品，用TX-XT plus質(zhì)構(gòu)儀進行測定。探頭選用直徑為5cm 的圓柱形探頭。壓縮探針速度為1mm/s，測試壓縮比為50%，平行測定6次。

1.2.7 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)

按照GB 5009.228-2016方法進行試驗。

1.2.8 TBARS的測定

參考馬麗珍等的操作方法略作修改，稱取10.0 g背部肌肉研細后，置于100 mL 的加蓋錐形瓶中, 加入50mL7.5%的三氯乙酸(含0.1%EDTA), 混勻后, 室溫放置30 min,浸漬液用雙層濾紙過濾。濾液重復用雙層濾紙過濾一次。取5mL 濾液加入25 mL 離心管中, 加入5mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液, 在90℃水浴40 min。之后流水冷卻。再加入 5 mL 氯仿并搖勻。分層后取上清液分別在532 nm和600 nm處比色。記錄吸光度值并用以下公式計算TBARS值。TBARS 值    與TBARS反應的物質(zhì)的量(TBARS) 單位表示為mg·MA/kg。

1.2.9 電子鼻檢測

參考楊茗媛等的操作方法略作修改，將不同處理組的大黃魚肌肉解剖，取背部同一部位肌肉0.50g于10mL頂空瓶中，加蓋密封，放入4℃樣品盤待檢，樣品平衡時間20 min，平衡溫度35℃, 取樣體積3mL; 進樣速度25mL/s, 進樣口溫度45℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 8.5 及 Origin 9.0進行數(shù)據(jù)分析處理,數(shù)據(jù)結(jié)果均以“mean±SD”來表示, 每組實驗重復5次。同一列中的不同小寫字母表示顯著差異(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對大黃魚肌肉貯藏期間細菌群落結(jié)構(gòu)的影響由表 1 可以看出，CK 組中的腐敗菌是希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、冷桿菌屬、摩根氏菌屬、氣單胞菌屬。在IC組中，希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、冷桿菌屬是優(yōu)勢菌，而在CD 組中，僅有希瓦氏菌屬和假單胞菌屬是優(yōu)勢細菌。Ge 等研究腐敗大黃魚肌肉中分離出10株菌，其中8株產(chǎn)生H?S的菌株與希瓦氏菌屬密切相關，另外的兩株分離株分別被鑒定為熒光假單胞菌和 Pfragi。加冰處理對摩根氏菌屬、弧菌屬與類香味菌屬有明顯的抑制效果，可能由于加冰處理抑制了嗜熱微生物的生長。但ClO?處理后大黃魚肌肉中的菌屬種類均顯著降低，由于 ClO?分子外層具有一對未成對的活潑的自由電子，具有很強的氧化能力，破壞微生物的結(jié)構(gòu)，從而改變微生物菌群結(jié)構(gòu)及造成數(shù)量降低。

2.2 不同處理方式對大黃魚肌肉菌落總數(shù)的影響

圖1表明，隨著貯藏時間的延長，各組菌落總數(shù)均呈上升趨勢。IC組前期上升趨勢較CK 組不顯著(p>0.05),后期上升趨勢有顯著差異(p<0.05)。從貯藏效果來看, CD 組>IC 組>CK 組，說明 ClO?冰殺菌及抑制細菌增長繁殖的效果優(yōu)于普通冰。ClO?分子外層具有一對未成對的活潑的自由電子，具有很強的氧化能力，可以使微生物中含有的蛋白質(zhì)(酶)中氨基酸間的鏈氧化斷裂，使蛋白質(zhì)失去活性，阻止細胞再生。季曉彤等研究也證 明了   可以起到殺菌并延長貨架期的作用。

2.3 不同處理方式對大黃魚肌肉pH的影響
圖2結(jié)果所示，在貯藏過程中，每組的pH呈先下降后上升趨勢。其中，CD組與前兩組比較有顯著性差異(p<0.05)。貯藏初期，魚體經(jīng)歷僵硬、自溶兩個過程中，僵硬期微生物使糖原和 ATP 分解產(chǎn)生乳酸、磷酸使肌肉組織酸性增強，導致 pH 下降，自溶期 pH 開始升高，由于肌肉中大量蛋白質(zhì)分解為氨基酸和可溶性含氮物，這為微生物的繁殖提供了條件。pH 下降后又開始緩慢上升是由于肌肉內(nèi)源性及微生物來源蛋白酶降解氨基酸產(chǎn)生胺類等堿性物質(zhì)所致。CD組的pH下降緩慢，ClO?具可以抑制蛋白質(zhì)(酶)中的氨基酸鏈發(fā)生斷裂，從而使蛋白質(zhì)失去活性，最終使糖原和ATP 分解產(chǎn)酸量減少。同時，ClO?處理后下降緩慢是由于微生物中的外源性蛋白酶失去活性，進一步抑制體系中產(chǎn)胺微生物的滋生，從而降低自溶程度，使pH 上升緩慢。

2.4 不同處理方式對大黃魚肌肉質(zhì)構(gòu)特性的影響

圖3結(jié)果表明，隨著貯藏時間的延長，CD組相比較CK組和IC組的硬度(A圖)、彈性(B圖)、咀嚼性(C圖)均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在貯藏3天后CD組下降速度較CK組和IC 組緩慢，出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。由于養(yǎng)殖大黃魚在死后，進入了僵硬期，肌肉的質(zhì)地特性受蛋白質(zhì)、水分、脂肪含量的影響，貯藏期間，肌肉的水分含量逐漸減少，脂肪和蛋白質(zhì)逐漸被氧化和分解：隨后由于內(nèi)源蛋白酶和腐敗微生物的降解導致蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，繼而導致硬度、彈性、咀嚼性等等指標下降。結(jié)果中 CD 組樣品的質(zhì)構(gòu)特性優(yōu)于 CK組樣品，這是由于樣品經(jīng)過ClO?處理后對微生物的抑制作用較強，微生物無法通過生物活性與代謝活動對大黃魚肌肉的蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響；  同時，冰藏的處理方式使樣品迅速降溫，抑制其組織內(nèi)部酶的活性及細胞的代謝，從而起到保持蛋白質(zhì)特性的目的。

2.5 不同處理方式對大黃魚肌肉TVB-N的影響

從圖4 中可知，隨著貯藏時間的延長，不同處理組的 TVB-N 值均呈上升趨勢且差異顯著(p<0.05)。在貯藏期間, IC組和CD組樣品的TVB-N值上升趨勢低于CK組。研究表明普通冰和ClO?可以抑制微生物的生長繁殖并降低內(nèi)源酶的作用，從而延緩蛋白質(zhì)的分解，降低魚肉的腐敗程度。CD 組相比于IC 組能夠較好地抑制 TVB-N值的上升，由于ClO?通過使微生物蛋白質(zhì)失活達到殺菌目的，有利于降低 TVB-N的生成速率，表明 ClO?可以有效抑制微生物的生長。

2.6 不同處理方式對大黃魚肌肉TBARS值的影響
TBARS 是評估脂質(zhì)氧化程度的重要參考指標，TBARS值與反應中產(chǎn)生的醛、酮等小分子物質(zhì)成正比，說明TBARS 值越大，其脂質(zhì)氧化程度越高。圖 5 表明不同處理組對養(yǎng)殖大黃魚肌肉的 TBARS 值的影響，貯藏初期新鮮大黃魚肌肉的 TBARS 值為 0.26mg/100g左右。貯藏前期, CD 組的TBARS 值均呈現(xiàn)上升趨勢且較CK 組和 IC 組差異極顯著(p<0.0001), 說明氧化程度嚴重; 其中, 貯藏初期IC組大黃魚肌肉的 TBARS 值上升速率低于 CK 組。貯藏前期 ClO?處理組上升較快，可能由于 ClO?具有強氧化性，使脂肪氧化成丙二醛(MDA)，隨后ClO?進一步將醛類物質(zhì)氧化為羧酸，使TBARS 含量下降。楊賢慶等研究不同濃度的 ClO?對羅非魚魚丸的 TBARS 值有較好的抑制效果，且低濃度的ClO?就能有較好的抑制效果，與本研究結(jié)果一致。

2.7 不同處理方式對大黃魚肌肉氣味變化的影響

電子鼻可以靈敏地檢測到不同大黃魚肌肉氣味的變化，利用電子鼻作為完善食品在保藏期間氣味變化的衡量標準，可以更準確直觀的反應大黃魚肌肉品質(zhì)變化及腐敗程度，避免主觀因素對感官評價的影響。圖6通過執(zhí)行載荷分析來消除冗余傳感器，根據(jù)分析，傳感器S2(氮氧化物)、S6(甲烷)、S7(無機硫化物)和S9(芳香成分，有機硫化物)對大黃魚背部肌肉具有較高的響應值，與前人研究結(jié)果相似。腐敗希瓦氏菌是一種典型的冷藏海魚腐敗菌，具有較強的腐敗活性，可產(chǎn)生H?S，還原TMAO等物質(zhì)；假單胞菌可以產(chǎn)生大量的醛、酮和酯類等物質(zhì)。圖7 表示不同處理條件下養(yǎng)殖大黃魚背部肌肉電子鼻PCA分析結(jié)果，每個橢圓代表不同處理組，橢圓分布距離越遠，說明氣味差異性越大。圖7的PC1、PC2的方差貢獻率分別為92.47%、5.17%,PC1、PC2的總貢獻率為97.64%。CK組、IC組、CD組分別在貯藏5d、9d、17d后的橢圓距離新鮮樣品(0d) 較遠, 這與菌落總數(shù)和TVB-N值一致，表明肌肉接近腐敗的終點。由于PC2的方差貢獻率為5.17%，說明ClO?對于大黃魚肌肉貢獻率影響不大，說明其貢獻率主要源于微生物腐敗以及蛋白質(zhì)自溶。

3 結(jié)論

通過高通量測序分析表明 ClO?處理能降低菌落總數(shù)，改變菌相組成。大黃魚肌肉經(jīng)過ClO?冰處理后，其TVB-N值、TBARS值、硬度、咀嚼性和pH等理化指標相較于冰藏保鮮變化較為小，表明ClO?冰可以使大黃魚肌肉保持較好的理化品質(zhì)，并延長其貨架期。同時，從氣味變化可以看出，肌肉經(jīng)ClO?冰處理后，不僅減少其品質(zhì)劣變而且又不影響大黃魚肌肉本身的風味。